联苯苄唑溶液微生物限度检查法方法学研究


日期:2019/04/01

建立联苯苄唑溶液微生物限度检查方法——需氧菌和霉菌、酵母菌采用薄膜过滤法,控制菌铜绿假单胞菌采用平皿法,金黄色葡萄球菌采用薄膜过滤法。经采用薄膜过滤法需氧菌和霉菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌回收率应不低于70%,铜绿假单胞菌回收率不低于70%。本次微生物限度检查法方法学研究,为外用溶液剂的微生物检查提供了参考依据。
文/ 刘九平,曾叶萍

 

溶液剂是药物制剂中应用广泛的一种剂型,由药物溶解于适宜溶剂(如:水、乙醇、植物油或其他液体)中制成,因其有着质量稳定,剂量小,携带、用药方便等特点,深受广大患者喜爱。联苯苄唑溶液为外用溶液剂,是药典收载品种[1]抗真菌药,适应症为:用于治疗各种皮肤真菌病,如手、足癣,体、股癣,花斑癣等。为建立联苯苄唑溶液的微生物检查方法,特进行本次联苯苄唑溶液微生物检查法方法学研究,为联苯苄唑溶液微生物[2]的检查提供依据,同时也为外用溶液剂的微生物检查法[3]方法学研究提供参考依据。

微生物限度检查法方法
取联苯苄唑溶液依法检查(《中国药典》2015年版四部通则1105、1106),需氧菌总数检查为薄膜过滤法(取供试品10 g,置无菌锥形瓶中,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL,摇匀使之溶解。取1:10供试液1 mL采用薄膜过滤法,每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 mL分5次冲洗),霉菌和酵母菌总数检查为薄膜过滤法(取供试品10 g,置无菌锥形瓶中,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL,摇匀使之溶解。取1:10供试液1 mL采用薄膜过滤法,每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 mL分8次冲洗),金黄色葡萄球菌检查为薄膜过滤法(取1:10供试液10 mL采用薄膜过滤法,每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗,每次100 mL)、铜绿假单胞菌检查为平皿法(100 mL)均应符合规定。

菌液制备
取上述经35℃培养18~24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜胰酪大豆胨液体培养物1 mL,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 mL含菌数不大于100 CFU的菌悬液,做活菌计数备用。
取经25℃培养24~72 h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 mL含菌数不大于100 CFU的菌悬液,做活菌计数备用。
取经25℃培养一周的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂培养物,加5mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子,洗取出孢子悬液1 mL,用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成1 mL含菌数不大于100 CFU的菌悬液。

微信截图_20190408143447.png

需氧菌计数法
供试液的制备:取供试品10 mL,置无菌锥形瓶中,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL,摇匀使溶解,作为1:10供试液。 
回收率测定:薄膜过滤法
试验组:取供试液1 mL,每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 mL,分5次冲洗,一筒加入含菌量不大于100 CFU铜绿假单胞菌试验菌1 mL,另一筒加入含菌量不大于100 CFU金黄色葡萄球菌试验菌1 mL,第三筒加入含菌量不大于100 CFU枯草芽孢菌试验菌1 mL(试验菌均在最后一次冲洗中加入)取出滤膜置胰酪大豆胨琼脂培养基贴膜培养,30℃~35℃培养24~120 h逐日观察结果。
菌液组:取45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 mL加入微生物限度检查专用滤器抽滤,一筒加入含菌量不大于100 CFU铜绿假单胞菌1 mL,另一筒加入含菌量不大于100 CFU金黄色葡萄球菌1 mL,第三筒加入含菌量不大于100 CFU枯草芽孢菌1 mL,立即贴膜于胰酪大豆胨琼脂培养基的平皿内,30~35℃培养24~120 h逐日观察结果。
供试品:取供试液1 mL,用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 mL,分5次冲洗,立即贴膜于倾注胰酪大豆胨琼脂培养基的平皿中,置35℃培养24~120 h逐日观察结果。(取1:10供试液1 mL,采用薄膜过滤法,每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 mL分5次冲洗,依照该法进行检查)。
按如下公式计算试验组的加菌回收率:

微信截图_20190408143612.png
结果为该株阳性菌的回收率,回收率应不低于70%。结果见表1。

微信截图_20190408143621.png

霉菌、酵母菌计数法
供试液的制备:取供试品10 mL,置无菌锥形瓶中,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL,摇匀使溶解,作为1:10供试液。
回收率的测定:薄膜过滤法
试验组:取1:10供试液10 mL,用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 mL分8次冲洗,一筒加入含菌量不大于100 CFU白色念珠菌,另一筒加入含菌量不大于100 CFU黑曲霉菌试验,取出滤膜置沙氏葡萄糖琼脂培养基贴膜培养,23~28℃培养24~168 h逐日观察结果。
菌液组:取45℃含2%吐温80的用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 mL分8次冲洗,一筒加入含菌量不大于100 CFU白色念珠菌,另一筒加入含菌量不大于100 CFU黑曲霉菌试验,取出滤膜置沙氏葡萄糖琼脂培养基贴膜培养,23~28℃培养24~168 h逐日观察结果。
供试品对照组:取供试液1:10供试液10 mL,用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 mL分8次冲洗,取出滤膜置沙氏葡萄糖琼脂培养基贴膜培养,23~28℃培养24~168 h逐日观察结果。(取1:10供试液10 mL,采用薄膜过滤法,每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 mL分8次冲洗,依照该法进行检查)。
按如下公式计算试验组的加菌回收率:

微信截图_20190408143747.png
结果为该株阳性菌的回收率,回收率应不低于70%。结果见下表2。

微信截图_20190408143753.png

控制菌检查方法
金黄色葡萄球菌的检查法:薄膜过滤法
供试液制备:取供试品10 mL,置无菌锥形瓶中,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 mL,摇匀使溶解,作为1:10供试液。
试验组:取1:10供试液10 mL,采用薄膜过滤法,每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗,每次100 mL。同时加入上述金黄色葡萄球菌液不大于100 CFU,取膜加入100 mL胰酪大豆胨液体培养基中,35℃培养24 h,划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上,35℃培养24~72 h,观察。(取1:10供试液10 mL,采用薄膜过滤法,每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗,取膜加入至100 mL胰酪大豆胨液体培养基内,依法检查)。
阴性对照组:每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗,每次100mL。取膜加入100 mL胰酪大豆胨液体培养基中,35℃培养24 h划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上,35℃培养24~72 h,观察结果见表3。
铜绿假单胞菌的检查法:平皿法
供试液制备:取供试品10 mL,置无菌锥形瓶中,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 mL混匀,作为1:10供试液。
试验组:取1:10供试液10 mL加入100 mL胰酪大豆胨液体培养基中,摇匀,35℃培养24 h,观察。取上述培养物,划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上,35℃培养24~72 h,观察结果。(取1:10供试液10 mL,采用平皿法,加入至100 mL胰酪大豆胨液体培养基内,依照该法进行检查)。

微信截图_20190408143920.png

微信截图_20190408143929.png


阴性对照组:取供试液10 mL,加入100 mL的胰酪大豆胨液体培养基中,摇匀,35℃培养24 h,观察。取上述培养物,划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上,35℃培养24~72 h,观察结果见表4。

结论
经过对联苯苄唑溶液外用溶液剂微生物限度检查法方法学研究试验,试验过程各检查法可操作性强,数据重现性好、方法可靠,为外用溶液剂微生物限度的检查提供了参考依据。

[参考文献]
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:二部.北京:中国医药科技出版社,2015:1264.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部.北京:中国医药科技出版社,2015:140~149.
[3]中国药品生物制品检定所,中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规程(2010年版):中国医药科技出版社:49.